你的身体与年纪相符吗让生命时钟染色体端粒告知你答案

文章来源：用心科普抗衰老知识的公众号【时光派】

撰稿人：时光派研究所

编者按：从“海弗利克极限”到端粒酶基因疗法，科学家对端粒与衰老关系的好奇心从未减弱。端粒一直以来都被看作是衰老的生物标志物，然而端粒的哪些维度可当作临床的衰老生物指标呢，本文编译自《The telomere world and aging: analytical challenges and future perspectives》（原作者Emanuela Mensa）将对此做介绍。该原文更注重技术分析，但是考虑到大多读者非科研人员，这里对于测量技术仅做概述。

端粒是真核生物染色体的终端核蛋白结构，在保护染色体DNA末端中起关键作用。许多证据表明，端粒除了保持染色体稳态，还参与调节基因的表达，并调控与应激相关的信号通路。

端粒长度（telomere length，TL）具有物种特异性和遗传性。其在各时间的值取决于遗传特征以及“缩短”和“延长”信号间的平衡。

端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，主要由端粒酶模板RNA（TERC）、端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒相关蛋白（TEP）三部分所组成。它在大多数真核细胞中负责保持“复制潜能”，并且还参与从维持端粒长度、基因组稳定性到组织更新和线粒体保护等多种功能。

端粒长度是胚胎干细胞的代谢活性和多能性的标志，在胚胎细胞中，端粒酶具有活性，并且可以保持端粒长度恒定；在成体干细胞中，端粒酶只有有限的活性，仅对端粒的缩短提供部分补偿；而在体细胞中，端粒酶一般没有活性。因此，在体细胞和机体的老化过程中，端粒的缩短率远超延伸率。当端粒达到临界长度时就会引起端粒功能障碍，并激活DNA损伤反应，这会导致细胞的衰老表型。

端粒长度一直以来被认为同时与细胞衰老和机体衰老密切相关（细胞衰老与机体衰老并不等同，但在两种情况下均发现了端粒的缩短），它也被看作衰老的生物标志物，并且是老年病发生和进展的风险因素。

近年的研究发现，一种含有端粒重复序列的非编码RNA（telomeric repeat-containing RNA，TERRA）也参与了端粒维持机制。在体内和体外的数据中均发现了端粒长度和TERRA的负相关，对于这一现象科学家提出了两种假设：TERRA的转录可以促进染色体末端5’-3’核酸酶的活性；或者端粒缩短会诱导TERRA表达，从而在短端粒中调控端粒酶的招募和活性。

由于“端粒长度”、“TERRA”和“端粒酶活性”三个元素均表现出了衰老生物标志物的潜质，因此关于其的测量对于抗衰老就特别的重要，对于它们的测量技术的研究有五项重点：

1）如何准确测量；

2）各技术的优缺点；

3）改进的空间；

4）与端粒长度有关的化学临床变量与衰老和老年病的联系；

5）需要人类纵向研究来评估特定方式（如药物或营养物质等）在衰老期间对端粒缩短的逆转能力。

解决这样一些问题有助于更加客观地看待端粒长度相关研究及其广泛的成果。同时这样一些问题也直接制约着端粒测量在临床上的应用。

（编者注：纵向研究是指在一段相对长的时间内对同一个或同一批“被试”进行重复的研究）

在介绍端粒长度、TERRA和端粒酶活性与衰老的关系，及基于它们的各种测量方式（这里只涉及适用于临床和流行病学的方法）之前，了解三者的细胞和亚细胞定位，有助于我们从更高的层面来评价它们的测量方式。

最近的研究强调了端粒和端粒相关序列（端粒的分子结构请参考链接）的一系列可能的胞内和胞外定位（如下图所示）。

可见，端粒相关序列不仅存在于细胞核中也存在于细胞质，甚至胞外的外泌体中。因此在端粒的测量中，不同的样本和提取方式/产品将会影响最终的测量结果。

一、端粒与衰老及端粒长度的测量

1、端粒与衰老

许多流行病学研究发现了端粒磨损和衰老以及一些生物数据如发病率和死亡率间的联系。

比如，在欧洲老年人群中发现，短的白细胞端粒是机体功能下降的独立风险因素；也有研究表明端粒磨损与BMI增加有关，这为联接肥胖与衰老提供了一条可能的通路。然而，这些研究中使用的大多数方法学都不在预期之内，因此得到的重要实验参数和端粒长度之间的关系受到了质疑。

除此之外，最近的证据表明，端粒长度可能无法在老年人群中作为功能性衰老的临床标志物，然而它在涉及年轻人和中年人群的纵向研究中却表现出了关键的作用。而且，在不同的细胞类型中，端粒的磨损率也不同，即不同的组织和器官的衰老速率不同。另外，端粒磨损率的高个体间变异也在纵向研究中被报道。

这些异质性恰恰表明，相比于“时间”年龄，“生物”年龄能够更加准确地预测衰老的速度。端粒长度正是目前研究最广泛的“生物年龄预测子”（虽然新的预测子“表冠遗传学时钟”正在兴起）。

注：许多证据表明，不同的预测子可以反映衰老的不同方面，尽管它们之间可能本身就有联系。目前端粒研究最吸引人的领域是探究端粒缩短如何诱导与人类衰老相关的表冠遗传和基因表达的改变。多种预测子的联用能够在一定程度上帮助我们更好地预测复杂的衰老进程。

慢慢的变多的证据表明白细胞端粒长度与功能障碍相关，可是两者间并没有表现出线性关系，因而，“短端粒”而不是端粒长度可能可当作衰老和老年病的信息化标志物。尽管如此，端粒长度仍被广泛地用作衰老生物标志物，并被许多人努力地尝试向临床转化。

然而，端粒长度从研究到临床的应用被一些生物因素制约，包括，端粒长度对遗传、表冠遗传、环境和行为因素的依赖；同时也被一些技术因素制约，包括，预分析和测量技术标准化差的问题。

下面就列出一些常用的端粒长度测量技术。

2、端粒长度的测量

端粒长度的测量最常用的四大种方法分别是：

1）末端限制性片段（TRF）分析（Southern blot）；

2）荧光原位杂交技术（FISH），包括定量荧光原位杂交（Q-FISH）和流式荧光原位杂交（Flow-FISH）；

3）基于聚合酶链式反应（PCR）的分析技术，如，定量PCR（qPCR）、单链端粒长度分析（STELA），和端粒最短长度分析（TeSLA）；

4）基于全基因组测序（WGS）的分析技术。

其中末端限制性片段分析被称作端粒长度测量的金标准，然而在临床和流行病学研究中应用最多的方法却是qPCR和FISH。

虽然低创的DNA采集方式被慢慢的变多地使用，但是最常用于端粒长度检测的样本仍然为静脉血。然而，对于不同样本与端粒长度检测值的关系目前仍然知之甚少。最近的研究发现，手指刺破干燥血点（finger-prick dried blood spot，DBS）和唾液是微创静脉抽血的可行替代。有必要注意一下的是，唾液中的端粒长度值要高于全静脉血和DBS中的值。

需要指出的是，以上所有方法的开发都基于“端粒只位于真核细胞核内”的认识，然而，通过前面的说明，我们现在知道这个认识是错误的，因此，如何开发对核外或胞外的端粒长度的测量方式是一个新的挑战。

二、TERRA与衰老及TERRA的测量

1、TERRA与衰老

研究发现，通过与DNA结合，一种含有端粒重复序列的非编码RNA（TERRA）会特异性地在短端粒末端聚集，标记这些端粒需要修复，从而参与端粒长度的维持。在长端粒中TERRA的结合会被Rat1和RNase H2迅速移除，从而不会使长端粒延伸。【1】

在过去十年里，TERRA的基因位点一直是端粒生物学中悬而未决的问题。新观点认为，TERRA分子几乎可以从所有哺乳动物细胞中的端粒转录得到，并且转录方向总是从着丝粒到端粒。另一个被认为可能的位点是亚端粒区域（具有转录活性的基因组区域，根据转录起始位点的不同，会产生大小从100到9kb不等的长非编码RNA）。

在人的血液和血清中还检测到了无细胞TERRA（cf-TERRA）序列，主要在外泌体中。另外在人肿瘤组织中检测到了高水平的TERRA，因此TERRA可能被用于新的癌症标志物。

有必要注意一下的是，TERRA在染色体末端形成RNA:DNA杂合体，并折叠成为G-四链体（对比通常DNA为双链结构）。

G-四链体

最近的研究表明，癌基因和端粒DNA启动子区域的G-四链体单元可能是癌症患者中的治疗靶标。

2、TERRA的测量

TERRA测量最常用的方法有：

1）RT-qPCR；

2）RNA印迹（Northern blot）；

3）RNA斑点杂交（RNA dot blot）；

4）使用特异性抗体的G-四链体检测。

TERRA测量面临的最大问题就是转录可以从所有染色体的亚端粒区域开始。为了解决这一问题，许多针对不同亚端粒区域的特异性引物被使用，包括匹配以下染色体的引物：1q、2q、3p、7p、10p、10q、12q、13q、14q、15q、17p、17q、18p、XqYq和XpYp。其中一些位点似乎比其它位点与TERRA的转录更相关。20q和Xp染色体被认为是TERRA在人细胞中最主要的位点。

三、端粒酶活性与衰老及端粒酶活性的测量

1、端粒酶活性与衰老

端粒酶是唯一一种可以延长端粒的酶。与其它的酶类不同，它自带一段单链端粒模板（TERC）。

由于端粒酶活性在80-90%的肿瘤细胞中可见，因此它作为诊断/预后的肿瘤标志物的价值促使了可靠和标准化的检测方案的发展。

然而，端粒酶在正常衰老细胞中的作用尚未得到深入研究。在成人真皮成纤维细胞（HDFS）的衰老原代培养中，端粒酶逆转录酶（TERT）水平降低，端粒酶活性减少。

端粒酶的活化或替换具有治疗端粒维持缺陷综合症患者的潜力，另外对其进行组织工程化设计，具有治疗与正常衰老相关的退行性疾病的潜力。在端粒功能障碍小鼠模型中发现，端粒酶的再活化延长了端粒长度，减少了DNA损伤信号通路，并且消除了多器官的退行表型。

另一方面，临床研究也聚焦于通过抑制端粒酶的肿瘤治疗方案。因为大多数体细胞的端粒酶活性较低，因此端粒酶在癌细胞中的选择性失活并不可能影响大多数正常细胞，这表明端粒酶是肿瘤治疗的良好靶点。

端粒酶活性也被认为是心血管老化和心血管疾病的生物标志物。最近的研究表明他汀类药物与端粒生物学之间存在联系，这可能是因为他汀类药物的抗炎作用。

2、端粒酶活性的测量

端粒酶活性的分析方法可分为两类：一是基于直接测量端粒酶的产品，另一是基于产品扩增的不同系统。

前者包括放射性标记底物直接掺入法检测端粒酶活性（主要问题：放射性物质使用时的复杂性和危险性）；后者包括端粒重复扩增法（TRAP）（主要挑战包括吞吐量、用非标记化合物替换放射性标签、减少副产物的数量、消除引物二聚体伪影和假阳性扩增产物，以及减少样品内和样品间的差异）。

基于直接测量端粒酶的产品的新生物分析方法包括无PCR检测（PCR-free assays）、等温扩增（isothermal amplification）和单分子随机结合试验（Single Molecule Stochastic Binding assay），这些方法不仅应用于细胞和组织端粒酶活性的检测，也应用于体液。

多种方法也被提出应用于分析端粒酶基因活性，包括TERT选择性剪接、TERT基因扩增和表观遗传改变。

四、有关端粒的生物变量

一些生物变量也与端粒的指标相关，比如年龄、性别和种族被发现与端粒长度显著相关，例如，女性和非洲或西班牙裔就比男性和欧洲人更倾向于有较长的端粒。

除此之外，白细胞端粒长度和血液参数之间被发现有弱相关；炎症和端粒磨损显著相关；吸烟、体重增加也与端粒磨损有关；长端粒与多种癌症风险相关，然而，综合数据表明短端粒与癌症患者较差的预后相关。

尖端技术的端粒长度、TERRA和端粒酶活性测量技术仍处于起步阶段，但通过方法的改进，和慢慢的变多的提供相关服务的实验室，我们相信它会有一个光明的未来。技术的进步预期能够使我们也可以在统一样本中快速、自动化的进行标准化端粒长度、TERRA和端粒酶活性的测量，且样本应不局限于细胞和组织，还将包括体液和循环囊泡。预计这些新技术将在有关衰老本身和一些老年病相关的研究中提供更一致的数据。

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